成簇规律性间隔短回文重复序列（CRISPR）系统可以通过crRNA快速靶向特定基因序列(激活剂)，激活Cas核酸酶的反式或顺式切割活性，是强大的核酸识别器和信号放大器。但现有的激活方式只有基于单链或双链激活剂两种，在特异性或通用性方面具有天然的瓶颈，限制了CRISPR技术在点突变检测等高精度分子识别中的应用。因此，开发一种新的无限制CRISPR激活模式是很有必要的。它不仅将拓宽CRISPR技术在生物医学领域的应用，而且在高精度分子传感、生化电路、DNA反应网络等方面显示出巨大的潜力。
2022年11月1号，我校检验医学院谢国明教授POCT&Biosensor课题组在国际知名期刊《Nucleic Acids Research》（核酸研究）上在线发表题为“A PAM-free CRISPR/Cas12a ultra-specific activation mode based on toehold-mediated strand displacement and branch migration”的研究成果，提出了一种基于TSDR和BM的CRISPR/cas12a激活新模式。
课题组系统性地研究了单链激活模式的“马虎”，和双链激活模式的“死板”，由此启发了开发新型激活模式(Toehold-activation, TOA)的方向：将含有toehold的双链DNA作为CRISPR-Cas12a的激活剂，通过严格的TSDR形成DNA/crRNA复合物并精确激活Cas核酸酶。根据TSDR的特征，TOA中的单碱基错配将显著减少DNA/crRNA复合物的形成，从而降低激活效率，进而影响Cas12a的反式切割活性，特异性地区分突变靶标。
通过研究TOA的结构及工作原理，课题组发现这种模式完全消除了对PAM的需要，不同toehold方向、位置和序列的TOA都具有高度一致性的激活效率。此外，toehold个数对激活效率的影响具有严格的规律性，这使TOA模式比单链激活模式更稳定。然后，作者研究了不同toehold长度，方向和结构的TOA对四种不同位置的单碱基错配的识别特异性，发现该激活模式的拥有显著高于传统的单链或双链激活模式的特异性。高度一致的特异性规律表明我们可以通过改变toehold灵活地调节检测性能，并且可以扩展到任何靶标，具有超过双链激活模式的通用性。
作者通过BM反应暴露TOA的toehold，将两者级联，进一步提高了特异性和反应产率(称为BM-TOA系统)。该系统在无需引入任何额外错配的情况下实现了12种单碱基错配的高特异性鉴别，相较于单链激活模式或双链激活模式，特异性提高了80倍，能检测低至0.1%的T790M和L858R突变。进一步检测了L858R突变的临床样本，结果与dPCR高度一致，证明了其实际应用潜力。
三种激活模式的特性
BM-TOA系统的性能探究
单链探针检测BMP-like target的低丰度点突变
这种激活模式对Cas核酸酶亚型没有严格的要求，可扩展到其他CRISPR-Cas系统。BM-TOA策略的这些优势极大地促进了CRISPR技术在生物医学和高精度分子识别领域发挥更大的作用。
谢国明教授、杨宇君副研究员和李俊杰副研究员为该文章的共同通讯作者，临床检验诊断学硕士研究生吴优、博士研究生罗旺为本文共同第一作者。谢国明教授POCT&Biosensor课题组长期致力于链置换的调节规律及相关临床应用的研究工作，研究成果相继在《ACS Nano》《Biosensors & Bioelectronics》《Sensors and Actuators B: Chemical》等国际学术期刊上发表。
该研究得到了国家自然科学基金面上项目、重庆市自然科学基金项目、重庆市研究生科研创新项目的资助。
原文连接：
https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkac886/6786210
